Od roku 1888 se intenzivně zabýval studiem lidových písní a tanců, které často sbíral a zapisoval přímo v terénu. O folkloru napsal několik zasvěcených teoretických prací a spolu s Františkem Bartošem vydal sbírku Kytice z národních písní moravských.
Roku 1890 potkala Janáčka a jeho ženu těžká rána v podobě smrti jejich dvouletého syna Vladimíra. Janáčkova tvorba počátku devadesátých let byla ve znamení moravského folklorismu. Vznikly četné Janáčkovy úpravy lidových písní a tanců, stylizované orchestrální Valašské tance, obrázek z moravského Slovenska Rákoš Rákoczy a operní jednoaktovka Počátek románu. Vedle zkoumání lidové písně se Janáček začal zajímat o psychologii a její projevy v mluveném projevu, který považoval za jakási „okénka do duše“ lidí. Nápěvky mluvy, tedy melodické prvky řeči, byly podle Janáčka výrazem povahy a okamžitého rozpoložení člověka a byl přesvědčen, že lidskou řeč lze objektivně zaznamenat pomocí notového zápisu. Zapisování a sbírání nápěvků se Janáček věnoval od roku 1897 více méně po celý život. Nezůstal však jen u nápěvků lidské řeči – mezi více než třemi tisíci záznamy nacházíme např. i nápěvek štěkotu psa, pískání komára, vrzání parket či bzučení včely.
Novou kompoziční cestu Janáček nastoupil v opeře Její pastorkyňa podle dramatu Gabriely Preissové z moravského venkovského života. V této opeře komponované na prózu dospěl Janáček k osobitému hudebnímu výrazu. Postupně opouští tradiční operní schéma s uzavřenými čísly a áriemi, v orchestru se objevují charakteristické sčasovky na způsob rytmického ostinata, modální tónové útvary, zcela nová je hudební dikce vokálních partů jednotlivých postav, která vycházela z jeho zkušenosti ze studia lidské řeči. Operu Janáček dokončil po téměř deseti letech práce roku 1903. Práci na Její pastorkyni provázel zhoršující se zdravotní stav Janáčkovy dcery Olgy a skladatelova úzkost o její život. Když operu dokončil, zastihla jej nejtěžší životní rána – v pouhých jednadvaceti letech Olga zemřela.
Po odmítnutí uvedení Její pastorkyně pražským Národním divadlem se 21. ledna 1904 uskutečnila úspěšná premiéra v brněnském Národním divadle. Janáček byl do té doby ve společnosti vnímán jako ředitel a učitel, a jen okrajově jako skladatel, jelikož jeho tvůrčí činnost mohla doposud sledovat v podstatě pouze brněnská veřejnost. Velice stál o uměleckou přízeň Prahy a kontakt s pražským hudebním životem. Na obojí však musel čekat ještě dalších dvanáct let.