Novou kompoziční cestu Janáček nastoupil v opeře Její pastorkyňa podle dramatu Gabriely Preissové z moravského venkovského života. V této opeře komponované na prózu dospěl Janáček k osobitému hudebnímu výrazu. Postupně opouští tradiční operní schéma s uzavřenými čísly a áriemi, v orchestru se objevují charakteristické sčasovky na způsob rytmického ostinata, modální tónové útvary, zcela nová je hudební dikce vokálních partů jednotlivých postav, která vycházela z jeho zkušenosti ze studia lidské řeči. Operu Janáček dokončil po téměř deseti letech práce roku 1903. Práci na Její pastorkyni provázel zhoršující se zdravotní stav Janáčkovy dcery Olgy a skladatelova úzkost o její život. Když operu dokončil, zastihla jej nejtěžší životní rána – v pouhých jednadvaceti letech Olga zemřela.
Po odmítnutí uvedení Její pastorkyně pražským Národním divadlem se 21. ledna 1904 uskutečnila úspěšná premiéra v brněnském Národním divadle. Janáček byl do té doby ve společnosti vnímán jako ředitel a učitel, a jen okrajově jako skladatel, jelikož jeho tvůrčí činnost mohla doposud sledovat v podstatě pouze brněnská veřejnost. Velice stál o uměleckou přízeň Prahy a kontakt s pražským hudebním životem. Na obojí však musel čekat ještě dalších dvanáct let.
Po brněnské premiéře Její pastorkyně se Janáček dal penzionovat, aby se mohl nadále naplno věnovat své varhanické škole a kompozici. Tato doba je také počátkem jeho pravidelných návštěv „slovanských“ lázní v Luhačovicích.
Při jednom ze svých lázeňských pobytů se Janáček seznámil s Kamilou Urválkovou, jejíž životní příběh se stal předlohou pro Janáčkovu v pořadí čtvrtou operu Osud. Avšak tato novinka, která měla být nastudována novým Městským divadlem na Královských Vinohradech, nebyla nakonec za skladatelova života nikdy provedena.
Za hranicemi Brna reprezentovaly Janáčka zatím především sbory; vynikající Pěvecký sbor moravských učitelů se sbormistrem Ferdinandem Vachem a plzeňský sbor Smetana. Pro tato tělesa zkomponoval své bezručovské skladby Kantor Halfar, Maryčka Magdónova a 70.000. V době mezi brněnskou a pražskou premiérou Její pastorkyně vznikly mimo jiné další části lyrického klavírního cyklu Po zarostlém chodníčku, cyklus V mlhách, orchestrální balada Šumařovo dítě, kantáta Věčné evangelium či první znění symfonické rapsodie Taras Bulba.